Адрес e-mail:

Яд паука спасёт от паралича

Рисунок 1. Структура комплекса канала Nav1.4 из мышц человека с токсином Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei по данным ЯМР. (A) Комплекс Hm-3 (голубой/фиолетовый) с первым потенциал-чувствительным доменом (DI) канала (песчаный/красный). Вид сбоку, со стороны липидного бислоя. (В) Комплекс токсин-канал. Вид на плоскость мембраны со стороны внеклеточного пространства. Предоставлено Захаром Шенкаревым


Команда выпускников МФТИ совместно с российскими и зарубежными коллегами из других вузов обнаружила, что яд паука бокохода Heriaeus melloteei может стать основой для создания лекарств от гипокалиемического периодического паралича и других заболеваний, связанных с мутацией генов потенциал-зависимых ионных каналов NaV1.4 в скелетных мышцах. Эти мутации приводят к возникновению так называемых токов «утечки» через молекулу закрытого канала, в результате чего мышцы оказываются неспособны отвечать на сигналы нервной системы и развивается слабость вплоть до паралича. До сих пор надёжного лекарства от всех случаев этой болезни не существует. Результаты работы опубликованы в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS).

В состав любой клеточной мембраны входят ионные каналы — белковые поры, избирательно пропускающие ионы, а также специальные насосы — помпы, перекачивающие определенные типы ионов внутрь клетки и наружу. За счёт их работы мембрана оказывается неодинаково заряжена с двух сторон, то есть обладает разностью потенциалов. В отсутствие раздражающих стимулов потенциал поддерживается на постоянном уровне. Под действием разнообразных сигналов определенные ионные каналы открываются или закрываются, изменяя, таким образом, ток ионов внутрь и наружу клетки, а также заряд мембраны. В результате некоторые клетки (нервные, мышечные и железистые) возбуждаются — получают возможность отвечать на сигнал.

Однако порой гены, кодирующие каналы, оказываются повреждены, и ответ клеток может стать неадекватным. Например, дефекты потенциал-чувствительных доменов потенциал-зависимых натриевых каналов NaV1.4 в мышцах приводят к тому, что даже в закрытом состоянии они пропускают ионы натрия в клетку, меняя разность потенциалов мембраны. Сигналы от нервной системы более не способны возбудить мышцу — развивается паралич. У больных гипокалиемическим периодическим параличом второго типа развивается слабость вплоть до полного обездвиживания. К сожалению, существующие лекарства для облегчения их состояния зачастую неэффективны.

«Наша работа посвящена изучению потенциал-зависимых ионных каналов человека, в частности, рассмотрению мутаций NaV1.4 канала из скелетных мышц, отвечающих за развитие тяжелого заболевания — гипокалиемического периодического паралича второго типа. В работе впервые показано, что существуют природные соединения, способные заблокировать токи утечки через мутантные каналы», — рассказывает Михаил Кирпичников, выпускник МФТИ 1969 года, академик РАН, декан биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. 

Применяя целый арсенал методов генной и белковой инженерии, электрофизиологии, ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования, исследователи изучили причины «неправильной» работы повреждённого мутацией канала. В качестве блокатора был впервые предложен токсин Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei, и, согласно результатам, полученным с помощью сайт-направленного мутагенеза, электрофизиологии, ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования, он фиксирует потенциал-чувствительный домен канала в положении, устраняющем ток «утечки».

«Исследования структур комплексов ионных каналов с токсинами в мембране представляют непростую задачу. Основная проблема в нашей работе была связана с низкой стабильностью образцов в условиях ЯМР-эксперимента. Для её решения нам пришлось разработать целый ряд новых экспериментальных методик, что позволило ускорить процесс сборки структурных данных с нескольких дней до нескольких часов. В результате нам удалось впервые построить экспериментальную модель комплекса натриевого канала с токсином паука, а также охарактеризовать новый сайт связывания токсинов, который расположен на первом потенциал-чувствительном домене (DI). Ранее были известны сайты связывания, располагающиеся на втором и четвёртом доменах (DII и DIV). Полученные результаты указывают на возможность создания новых эффективных препаратов для лечения заболеваний, вызванных мутацией генов ионных каналов (каналопатий), используя в качестве прототипа токсины пауков», — заключает Захар Шенкарев, выпускник МФТИ 2000 года, профессор РАН, доцент кафедры физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ, руководитель группы в ИБХ РАН.

Рисунок 2. Структурная организация канала NaV1.4 в мембране (A,B) и сравнение последовательности первого потенциал-чувствительного домена (DI) с другими натриевыми и калиевыми каналами (B). Канал состоит из пяти мембранных доменов, четырёх потенциал-чувствительных, сформированных спиралями S1-S4 (голубые цилиндры), и одного порового, сформированного спиралями S5-S6 (серые цилиндры). На спиралях S4 находятся воротные положительные заряды (отмечены знаками «+»). Мутации соответствующих остатков приводят к токам «утечки», которые ответственны за возникновение ряда заболеваний (каналопатий), включая гипокалиемический периодический паралич (красные ромбы). В работе исследовали новую мутацию Arg222/Trp домена DI (красный ромб на панели C). Положение сайтов связывания токсинов пауков, влияющих на активацию канала, показано штриховыми рамками. Красная и зелёная — ранее известные сайты, фиолетовая — сайт на домене DI, впервые описанный в работе. Предоставлено Захаром Шенкаревым




Рисунок 3. Данные ЯМР-спектроскопии выявляют интерфейсы взаимодействия в комплексе токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei с первым потенциал-чувствительным доменом (DI) канала Nav1.4 из мышц человека. В работе использовали рекомбинантный 15N-меченый вариант токсина. 13C/15N-меченые образцы домена были получены методами бесклеточного синтеза. (A, B) Сравнение 2D 1H,15N-TROSY спектров DI и Hm-3 при разных молярных соотношениях токсин/домен. В качестве среды, моделирующей мембранное окружение, использовали смешанные мицеллы DPC/LDAO. (C) Интерфейсы взаимодействия токсина с мицеллой (синий) и доменом DI (фиолетовый) показаны на структуре Hm-3. Поверхность мицеллы (радиус 24 Å) показана серой сеткой. Дисульфидные связи показаны оранжевым. (D) Интерфейс взаимодействия с токсином Hm-3 показан на модели домена DI (красный). Показаны боковые цепи остатков, формирующих сайт связывания, а также боковые цепи консервативных положительно заряженных остатков Arg/Lys спирали S4 (воротные заряды). Гидрофобные алифатические и ароматические остатки, полярные незаряженные, положительно заряженные и отрицательно заряженные остатки показаны зелёным, фиолетовым, синим и красным цветами соответственно. Предоставлено Захаром Шенкаревым


Работа выполнена сотрудниками ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, МФТИ, а также зарубежными коллегами из Института неврологии Университетского колледжа Лондона и Школы медицины Университета Джонса Хопкинса в Балтиморе при поддержке Российской академии наук (программа «Молекулярная и клеточная биология») и Российского научного фонда (РНФ).



Если вы заметили в тексте ошибку, выделите её и нажмите Ctrl+Enter.

МФТИ в социальных сетях