Кратко:
- Диссертант: Остапченко Валерий Геннадиевич
- Название диссертации: "Каталитическая субъединица энтеропептидазы человека: получение, характеризация ферментативных свойств и моделирование мутаций, облегчающих ренатурацию и повышающих специфичность фермента"
- Защита состоится: 20 декабря 2006 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете), по адресу 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9.
- Язык диссертации: русский
- Ученая степень, отрасль науки: кандидат физико-математических наук
- Шифр специальности: 03.00.02 – биофизика
Цель работы: Получение рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека, исследование ее ферментативных и физико-химических свойств, моделирование структурных изменений, облегчающих ее ренатурацию, и исследование структурных элементов, ответственных за специфичность фермента при расщеплении пептидных субстратов.
Основные результаты: Впервые осуществлена экспрессия каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP) в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры. Впервые охарактеризована ферментативная активность каталитической субъединицы энтеропептидазы человека. Показано преимущество фермента человека по сравнению с ферментом быка при гидролизе рекомбинантных гибридных белков. Показана высокая устойчивость ферментативной активности L-HEP к действию денатурирующих агентов, таких как детергенты, повышенная температура, отличная от физиологической кислотность буфера и восстанавливающие агенты. Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсин-подобных сериновых протеиназ. Показано, что высокие концентрации NaCl и CaCl2 ингибируют расщепление специфических субстратов L-HEP, при этом не влияя на скорость гидролиза неспецифических субстратов. Построена пространственная модель L-HEP. Проведено молекулярное моделирование замещения цистеинов в положениях 122, 136 и 201 с целью получения фермента с более высоким выходом ренатурации. Получен мутантный вариант L-HEP/C122S, выход ренатурации которого в 4 раза выше, чем у дикого типа. Показано, что ферментативные свойства L-HEP и L-HEP/C122S практически не отличаются. Выявлена вторичная специфичность L-HEP к хромогенным субстратам и белкам с ароматическими и большими гидрофобными остатками в положении Р2. С помощью методов молекулярного моделирования определено, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 ответственны за различие ферментативных свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Получены мутантные варианты L-HEP с заменой остатков в этих позициях на соответствующие остатки каталитической субъединицы энтеропептидазы быка (L‑BEP). Показано, что остатки 96 и 219 влияют на константы связывания различных субстратов и частично определяют специфичность энтеропептидазы.
Результаты могут быть использованы в ИБХ РАН, Институте белка РАН, Центр "Биоинженерия" РАН, ИМБ РАН, Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН.
Доступные материалы:
- Текст автореферата (PDF, 2,38 Мб)
