Н.В. Романова, М.О. Агафонов*
Московский физико-технический институт (ГУ)
*ИЭК РКНПК МЗ РФ
Дрожжи часто используют для гетерологичной экспрессии эукариотических белков, поскольку дрожжевая клетка может обеспечивать общие для разных эукариот пост-трансляционные модификации. Одним из основных преимуществ экспрессии эукариотических белков в клетках дрожжей по сравнению с бактериями, это возможность получения секретируемого продукта. Однако не всегда возможно получить высокий уровень секреции гетерологичных белков при экспрессии в клетках дрожжей. Это может быть обусловлено недостаточным уровнем экспрессии такого белка, или из-за его малой способности к секреции. В нашей работе мы изучили факторы, влияющие на эффективность секреции урокиназы человека (u-PA) клетками дрожжей.
Анализ количества u-PA, продуцируемой трансформантами Hansenula polymorpha с различным числом копий соответствующих экспрессионных кассет, выявил негативную корреляцию между уровнями экспрессии u-PA и эффективности ее секреции. Одна копия экспрессионной кассеты давала максимальные уровни секреции урокиназы, тогда как дальнейшее увеличение экспрессии приводило к внутриклеточному накоплению неактивного и слабо гликозилированного белка.
Также мы проанализировали секрецию различных мутантных вариантов урокиназы в дрожжах H. polymorpha и S. cerevisiae. Делеция N-концевых доменов урокиназы довольно сильно увеличила ее секрецию, в то время как нарушение сайта N-гликозилирования – уменьшила секрецию урокиназы. Было обнаружено, что варианты урокиназы с низкой способностью секретироваться агрегируют в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР).
Низкая эффективность секреции урокиназы клетками дрожжей позволяет отобрать мутантные штаммы, с увеличенной способностью продуцировать этот секретируемый фермент. Такие мутанты ранее были изолированы в нашей лаборатории. Анализ свойств этих мутантов показал, что некоторые из них обладают фенотипами, которые позволяют предположить связь дефекта секреции урокиназы с процессами т.н. "контроля качества" сворачивания белков в ЭР и вакуолярной деградации.
