Д. Н. Калюжный, О.Ф Борисова, R. L. Jernigan, V. B. Zhurkin, А. К Щелкина
Московский физико-технический институт,
Институт молекулярной биологии РАН,
National Cancer Institute NIH
Трехнитевые нуклеиновые кислоты могут возникать в ходе различных биологических процессов, таких как рекомбинация. Параллельный (рекомбинантный) триплекс («R-форма ДНК») был предсказан теоретически и экспериментально изучен на внутри- и меж- молекулярных моделях в отсутствии белков. Однако детальная трехмерная структура гипотетического «триплекса» до настоящего времени отчетливо представляется только для G*(CG) и C*(GC) триплетов. В принципе, такой триплекс может получаться из любой нуклеотидной последовательности с двумя идентичными нитями ДНК, W и R, в параллельной ориентации. Мы показали, что 2-аминопурин, (2АР) -флуоресцирующий аналог аденина, может быть использован как структурный зонд для наблюдения образования триплекса, содержащего А и Т основания.
Были выбраны деоксирибонуклеотиды, потенциально способные образовать R-триплекс (RCW и R-2AP) или дуплекс (CW и ds-2AP):
RCW: 5’-GTAGACTGAG-TTTT-CTCAGTCTACGC-GAA- GTAGACTGAG-3’
R-2AP: 5’-GTaGACTGAG-TTTT-CTCAGTCTACGC-GAA- GTAGACTGAG-3’
CW: 5’-CTCAGTCTACGC-GAA- GTAGACTGAG-3’
ds-2AP: 5’-GTaGACTGAG-TTTT-CTCAGTCTAC-3’
ss-2AP: 5’-GTaGACTGAG-3’
(где “а”- 2АР; одна нить ss-2AP использовалась как контроль).
-GAA- линкер и две дополнительные GC пары приводят к стабилизации дуплексной части RCW и R-2AP, тогда как гибкая -ТТТТ- петля соединяет третью нить с дуплексом. Известно, что 2АР способен образовывать пару с тимином и потенциально может заменять аденин в A*(TA) триплете. Структура 2AP*(TA) триплета согласуется с R-формой. Раньше образование внутримолекулярных триплексов RCW и R-2AP наблюдалось с помощью двух методов: (i) УФ поглощение как функция от температуры и (ii) поляризация флуоресценции интеркалированного зонда ЕtBr. В этой работе мы показываем, что образование триплекса может быть независимо определено и по изменению флуоресценции 2АР.
Обнаружено, что интенсивность флуоресценции 2АР заметно различается для трех изучаемых олигонуклеотидов. При 3оС (0.5 M LiCl, tris pH 7.6), относительный квантовый выход флуоресценции 2АР в R-триплексе был в 1.6 раз больше, чем в дуплексе ds-2AP, и 1.7 раз меньше, чем в одной нити. Сигмоидальная температурная зависимость относительного квантового выхода в случае R-2AP отчетливо отражает конформационные изменения в структуре. Важно, что эти изменения проявляются в том же температурном диапазоне, как и разрушение стэкинга, наблюдаемое по УФ гиперхромизму. Мы относим эти изменения в R-2AP к плавлению трехнитевой структуры в структуру, состоящую из нативной дуплексной части CW и свободной третьей нити с разрушенным стэкингом около 2АР. Заметим, что дуплексная часть (CW) внутримолекулярного триплекса остается неизменной на этом температурном интервале.
По флуоресценции 2АР определены термодинамические параметры образования R-формы ДНК. Показано, что эти параметры хорошо согласуются с полученными по УФ гиперхромизму. Таким образом, детекция плавления индивидуального 2AP*(TA) триплета демонстрирует возможность использования 2АР как зонда трехтяжевых структур нуклеиновых кислот.
