Н. В. Фадеева, О. В. Крупник, Ю. С. Лазуркин
Московский физико-технический институт
Институт молекулярной генетики РАН
Пептидно-нуклеиновая кислота (ПНК) – уникальный искусственно синтезированный аналог ДНК [1] , образующий различные комплексы с комплементарными участками нуклеиновых кислот. Наиболее стабильным и специфичным комплексом является триплекс, образуемый гомопиримидиновой ПНК с двунитевой ДНК (днДНК). Сочетание высокой стабильности и специфичности триплексов делает ПНК перспективным антигенным и анти-сенс агентом, который находит множество применений в биотехнологии, а в перспективе, и в медицине.
На авторадиограммах опытов, в которых изучалась взаимодействие цитозинсодержащей бис-ПНК с днДНК, неоднократно наблюдались [2,3] более тяжелые комплексы, чем обычный триплекс, образуемый ПНК с днДНК. Такому полиморфизму до последнего времени не уделялось должного внимания. Между тем, это явление вносит неоднозначность в существующие методики применения ПНК.
В наших опытах при взаимодействии днДНК с бис-ПНК
на авторадиограмме помимо свободной днДНК
наблюдаются 3 комплекса. Самый легкий из них соответствует обычному
триплексу. Все три комплекса образуются на одной и той же мишени. При
исследовании кинетики диссоциации [4], вместо обычно наблюдаемого
экспоненциального убывания триплекса, наблюдалась более сложная
картина: график зависимости концентрации триплекса от времени проходил
через максимум, при этом концентрация более тяжелых комплексов убывала
экспоненциально. Это позволило предположить, что именно распад более
тяжелых комплексов дает вклад в рост концентрации триплексов. Изучение
отдельно выделенных комплексов и триплекса показало, что они
действительно распадаются по экспоненциальному закону. Комплексы
оказались достаточно устойчивыми (их время жизни в диапазоне температур
составляет порядка десятков минут), но менее устойчивыми,
чем триплекс. Для изучаемых по отдельности комплексов на основании этих
данных была построена модель диссоциации, которая позволила определить
относительный выход ДНК и триплекса. Для обоих комплексов он ,как
правило, составляет, с учетом погрешности эксперимента, 1:1.
На данный момент изучение полиморфизма продолжается с целью конкретизировать состав и структуру комплексов, научиться управлять процессом их образования. Задача эта чрезвычайно важна, так как тот факт, что один комплекс, образуемый ПНК с днДНК, переходит в другой, может отразиться на применении ПНК.
Литература
- Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications (1999) ISBN 1-898486-16-6 Horizon Scientific Press, Wymondham, UK
- G. Hansen, T. Bentin, H. Larsen and P. Nielsen. Structural Isomers of bis-PNA Bound to a Target in Duplex DNA. J.Mol.Biol. 307, p.67-74, 2001
- H. Kuhn, V.V. Demidov, P.E. Nielsen and M.D. Frank-Kamenetskii. An Experimental Study of Mechanism and Specificity of Peptide Nucleic Acid (PNA) Binding to Duplex DNA. J.Mol.Biol 286, p. 1337-1345, 1999
- Y.N. Kosaganov, D.A. Stetsenko, E.N. Lubyako, N.P. Kvitko, Yu.S. Lazurkin, P.E. Nielsen , Effect of temperature and ionic strength on the dissociation kinetics and lifetime of PNA-DNA triplexes. Biochemistry 39, 11742-11747, 2000.
