А. В. Бутыгин, В. А. Василисков, Д. В. Прокопенко, Д. В. Пышный.
Московский физико-технический институт
Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН
Новосибирский институт биоорганической химии РАН
Одним из важных применений биологических микрочипов в исследовании ДНК является секвенирование ДНК посредством гибридизации (SBH). Для увеличения эффективности SBH Лысовым и др.[1] было предложено применять гибридизацию олигонуклеотидов встык, использующую стэкинг взаимодействие (CSH-contiguous stacking hybridization). Позже было показано, что в некоторых случаях эффект стэкинга недостаточно велик для выявления четкой картины гибридизации [2]. Чтобы увеличить стабильность дуплексов со слабым стэкингом, мы решили использовать интеркалирующие агенты (акридин, феназин) из ряда описанных в работе Пышного и др.[3].
Был проведен параллельный термодинамический анализ коаксиального
стэкинга двух оснований, локализованных в одной цепи двухцепочечной
ДНК, в зависимости от 5’-модификации олигонуклеотидов интеркалирующими
агентами, акридином и феназином при двух значениях ионной силы (0,1М и
1М NaCl). Олигонуклеотиды были иммобилизованы в матрице трехмерных
полиакриламидных гелевых ячеек микрочипа (). Стэкинг был
изучен для всех комбинаций из двух оснований и оценен посредством
измерения увеличений (сдвигов) температур плавления и свободной энергии
дуплекса, сформированного стыковыми 5-мером и иммобилизованным на
микрочипе5’-модифицированным 10-мером. Было показано, что такие агенты,
как акридин и феназин, при различных комбинациях оснований в участке
стыка могут как стабилизировать, так и дестабилизировать тандемные
дуплексы. Стабилизация имеет место не только в случае совершенных
дуплексов, но и в некоторых случаях “мисматчей” и отступов (gaps).
Эффект стабилизации широко наблюдается в буфере с ионной силой 0,1М и
реже в буфере с 1М. Анализ влияния на дискриминацию мисматчных
дуплексов показал, что при использовании агентов дискриминация растет
в, примерно, тридцати процентах случаев.
Литература .
- Lysov,Yu.P, Florentiev,V.L, Khorlin,A., Khrapko,K.,Shick,V., Mirzabekov,A.D. (1988) A new method to determine the nucleotide sequence by hybridizing DNA with oligonucleotides. Proc. Acad. Sci. USSR, 303, 1508-1511.
- Vasiliskov,V.A., Prokopenko,D.V. and Mirzabekov,A.D. (2001) Parallel multiplex thermodynamic analysis of coaxial base stacking in DNA duplexes by oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucl. Acids Res. 29(11), 2303–2313.
- Пышный, Д.В., Лохов, С.Г., Сильников, В.Н., Шишкин, Г.В., Иванова, Е.М. и Зарытова, В.Ф. (1999) Влияние структуры азинов, присоединенных к 5’-концевому фосфату олигонуклеотида, на термодинамику образования комплементарных комплексов. Биоорг. Хим., 25(1), 40–55.
